荧光显微镜是生命科学研究的一双重要“眼睛”。科学家可以用荧光分子标记细胞、蛋白质，再观察它们出现在哪里、怎样运动以及信号如何变化。

不过，普通荧光成像主要看亮度。一个位置更亮，可能意味着目标分子更多，但也可能只是荧光探针更多、激发光更强，或者组织对光的衰减更少。因此，“变亮了”并不总能直接告诉我们分子发生了什么变化。

除了亮度之外，荧光其实还隐藏着另一个重要信息：寿命。

荧光分子吸收光子后，会短暂进入激发态，随后返回基态并释放光子。它在激发态平均停留的时间，就是荧光寿命（Fluorescence Lifetime）。

与亮度相比，荧光寿命不容易受到探针浓度和激发功率等因素影响，却会随着荧光分子构象和周围微环境发生变化。在显微成像中测量这一时间信息的技术，被称为荧光寿命成像显微术（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）。借助 FLIM，研究人员可以进一步了解离子浓度、能量代谢、分子相互作用和蛋白质构象等传统强度成像难以直接观察的信息，被广泛应用于神经科学、细胞生物学、免疫学、结构生物学和病理学研究。

但这种信息更丰富的成像方式，一直受到一个现实问题的限制：太依赖光子（光的最小单位）。传统 FLIM 要反复激发同一个像素（样本里的同一个区域），积累大量光子的到达时间形成直方图，再估算荧光寿命。这不仅拖慢成像速度，提高激发功率，还可能加重光漂白和光毒性。

近日，清华大学戴琼海院士、吴嘉敏副教授团队在 Nature Biotechnology发文。他们提出首光子事件感知荧光寿命成像方法 EFLIM（event-based first-photon FLIM），这种方法不再等待每个像素积累大量光子，而是重新利用每一次激发及首达光子的时间信息。即使平均每个像素探测到的光子低于 1 个，EFLIM 仍能恢复出稳定的荧光寿命图像。

为什么一定要垒直方图？

荧光寿命的定量测量可追溯至 20 世纪早期，但直到 20 世纪 90 年代，将寿命测量与显微成像结合的荧光寿命成像技术（FLIM），才真正得以实现。时至今日，FLIM 已被集成到一些商业显微系统中，但其使用相较强度成像仍未广泛普及。一个关键瓶颈在于：荧光寿命的精确估计极度依赖海量光子的累积。

传统 FLIM 通常使用脉冲激光激发样品，再记录荧光光子相对于激发脉冲的到达时间。由于单个光子的发射时间具有随机性，研究人员需要反复激发同一个像素，把大量光子的到达时间“垒”成一张直方图，再通过数学拟合估算荧光寿命。

“直方图需要足够多的光子才能垒得完整，一般认为每个像素点至少需要积累 3,000 个光子；即便在对精度要求较低或算法有所优化的情况下，数百个光子也是维持寿命估计可信度的底线。”这项研究的第一作者周逸亮表示。

然而，真实的生物样品不会那么“客气”。为了获得更多光子，研究人员可以延长采集时间或提高激发功率，但前者可能错过快速变化的生命过程，后者则会增加光漂白和光毒性。进入深层组织后，激发光和返回的荧光还会被组织吸收衰减，问题更加严重。

因此，在光子很少的情况下，怎样估算荧光寿命是这个领域需要解决的重要问题，也是这项工作关注的核心。

周逸亮此前学习光学，是实验室里第一个系统开展荧光寿命研究的人。从系统搭建、参数调试到算法仿真，他几乎从头学起。最初，团队和许多同行一样，把主要精力放在如何从稀疏、不完整的光子直方图中得到更好的寿命估计。“我们围绕这件事转了很久。后来突然想到，大家都在垒直方图，但为什么我们一定要垒直方图？”他回忆道。

在周逸亮看来，这个转折也是整项研究中最有意思的部分：“我们突然意识到，不一定非要重复别人上来第一步就做的事情，或许可以尝试一些更有意思、更勇敢，甚至更加疯狂的操作。”

于是，团队决定回到更原始的数据层面。EFLIM 不再先把多次激发结果合并，而是把每次激光激发视为一个独立事件：这次有没有探测到光子；如果有，第一个光子何时到达。

这一思路受到 2014 年发表于 Science的“首光子成像”（First-photon imaging）研究启发。该方法利用每个像素最先探测到的光子及其到达时间，在极低光照下恢复宏观场景的反射率和三维结构。“这项工作用首光子到达时间估计场景信息，我们就想到，在荧光寿命显微成像中，能不能也充分利用这个时间来估算荧光寿命？”周逸亮说。

（来源：Nature Biotechnology）

他解释道，之所以关注首光子，并不是因为第一个光子天然包含更多信息，而是受到探测器工作方式的影响。在一次激发周期内，许多单光子探测系统通常记录最先到达的光子；在极低光照下，每次激发也往往只有一个光子，甚至没有光子。与其把这些记录合并成高度稀疏的直方图，不如围绕每次激发和首光子重新设计寿命估计方法。

光子这么少，AI 怎样估算寿命？

但只有零散的首光子事件，还不足以让每个像素独立算出寿命。EFLIM 的另一个关键，是将原本的寿命参数估计，转化为时空自监督去噪问题。

荧光分子每次被激发后，在激发态停留的时间具有随机性，但大量事件在统计上遵循一定规律，荧光寿命可以理解为这一随机分布的平均值。EFLIM 利用这一特点，综合相邻位置和前后帧中的稀疏光子信息，估计平均首光子到达时间，再将其转换为表观平均寿命。

团队最初也考虑过传统的有监督学习，即让模型把高光子寿命图像作为标准答案。但荧光寿命对分子构象和局部微环境非常敏感，不同样本之间即使只有细微差别，寿命分布也可能发生变化。要让一个模型适用于多种生物场景，就需要采集大量覆盖不同样本的高光子训练数据，成本高、难度也很大。

因此，团队转向自监督学习。模型不需要把高光子寿命图像作为训练标签，而是利用稀疏数据自身构造学习信号。首光子事件表示解决了怎样利用每次激发的问题，自监督学习则解决了没有大量标准答案，模型怎样训练的问题，两者共同构成了 EFLIM 的技术架构。

不过，借助相邻位置和前后帧进行估计，也带来一个疑问：AI 会不会只是在“猜”出一张看起来清楚的图？

“光子越多，信息越多，估计结果就越接近真实值。当光子实在太少时，寿命估计一定会出现更大的偏差。”周逸亮说，“重要的不是声称完全消除偏差，而是尽可能定量地把偏差标定出来。”

为此，团队首先通过仿真改变光子数量、寿命分布和样本运动速度，观察误差如何变化，判断方法在什么条件下可信、在什么条件下可能失效。随后，他们又使用真实样本进行验证：先以大量光子获得参考结果，再逐步降低光子预算，与 EFLIM 的估计结果比较。

用于基础验证的是一块固定松茎横切片，这块样品已经在实验室放了四五年，周逸亮把它从角落里翻出来。由于其中恰好具有丰富的微观结构和不同寿命分布，它最终成了检验 EFLIM 准确性和适用边界的合适样本。

团队先对每个像素进行 20 万次激发，获得高光子参考数据，再从中抽取少量激发事件，模拟不同光子预算。在每个像素每帧仅进行 10 次激发、平均获得约 0.025-0.15 个光子的条件下，EFLIM 仍恢复出稳定的荧光寿命结构，寿命信噪比约为 17dB。优于其他方法在每像素进行 1 万次激发、平均获得 25-150 个光子时的结果，实现了两个数量级以上的有效光子效率提升。

（来源：Nature Biotechnology）

从活细胞到肿瘤组织，EFLIM 能用在哪里？

团队进一步将 EFLIM 应用于清醒小鼠脑内成像、活细胞钙信号成像、淋巴结免疫反应成像和人脑胶质瘤组织快速无标记成像。

在清醒小鼠脑内成像实验中，动物运动、血流变化及钙活动都会引起荧光强度波动，容易干扰传统方法的判断。团队在约 250 微米深的脑组织中记录神经元活动，EFLIM 能够减少运动伪影和强度变化对寿命估计的影响，在低光子条件下获得更稳定、可重复的寿命读数，展现出其用于清醒动物脑内神经活动观测的潜力。

团队用 EFLIM 观察 HeLa 细胞内的钙信号时，在高速成像（每秒 30 帧）、每个像素平均只有 0.2-0.5 个光子的条件下，清晰捕捉到了钙信号的动态变化，准确计算出钙离子浓度的定量波动，解决了传统 FLIM 成像慢、信号弱的问题。

在淋巴结免疫反应成像中，团队用 EFLIM 在单一光谱通道中，根据不同免疫细胞的荧光寿命差异，清晰区分了 B 细胞和 T 细胞，还观察到 T 细胞释放的囊泡样结构，以及这些囊泡可能介导的细胞间通信，为免疫反应研究提供了新视角。

（来源：Nature Biotechnology）

传统病理检测需要对组织进行染色，过程繁琐且耗时。EFLIM 可以利用生物组织内源性分子的自发荧光寿命，实现无标记成像，快速区分胶质瘤组织中的肿瘤细胞、正常细胞、血管、坏死区域等。而且成像速度快、覆盖范围广，能拼接成厘米尺度的组织图像，有望用于肿瘤边界识别、术中实时评估，为临床治疗提供参考。

（来源：Nature Biotechnology）

但 EFLIM 的潜在应用并不限于这几个场景。周逸亮认为，只要光子受限，这项方法就可能发挥作用。例如在深层组织、视网膜和其他低光度成像场景中，样本无法承受过强照射等。

EFLIM 还可能拓展荧光寿命探针的应用空间。目前，可用于定量寿命读出的高性能探针仍相对有限。通过降低寿命估计对光子数量的需求，EFLIM 有望提升信号较弱或表达水平较低的寿命探针在高速、低光照和深层组织成像中的可用性，拓展现有寿命探针的适用范围。

更长远的价值在于推动定量生物学。荧光寿命能够减少探针浓度、激发功率和部分强度伪影带来的干扰，使研究人员更定量地观察生物指标如何变化，并寻找免疫反应和神经活动中的新线索。

不过，周逸亮也坦言，EFLIM 仍有较大的优化空间。硬件方面，目前系统使用的光电倍增管对光子的探测效率有限。如果未来与量子效率更高的单光子探测器结合，有望进一步扩大其在极低光子条件下的适用范围。

另一个值得探索的方向是高通量多组分成像。荧光寿命可以作为区分不同分子或细胞组分的独立维度；将其与荧光强度、光谱和偏振等信息结合，有望在有限的探测通道内实现更高水平的多重成像，从而更全面地揭示复杂生物系统的分子组成、空间关系和动态变化。

1. Zhou, Y., Xiao, Y., Zhou, J. et al. High-fidelity fast fluorescence lifetime imaging by event-based denoising. Nat Biotechnol (2026). //doi.org/10.1038/s41587-026-03222-0

2. Kirmani A, Venkatraman D, Shin D, Colaço A, Wong FN, Shapiro JH, Goyal VK. First-photon imaging. Science. 2014 Jan 3;343(6166):58-61. doi: 10.1126/science.1246775.

排版：胡莉花

注:封面/首图由 AI 辅助生成